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1引言
隨著人們對健康環保紡織品需求的增加以及各國政府對環境保護強制力度的加大,在紡織印染行業中一種新型的紡織助劑———生物酶制劑的應用逐漸發展起來。目前,一種基于果膠酶的新型紡織生物助劑正在應用推廣中,它主要用于棉、麻的前處理工藝。由于紡織企業多數對果膠酶的生物特性不甚了解,在工藝應用過程中缺乏相應的檢測手段,使其推廣受到限制。酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量的重要指標,因此,建立適用于紡織行業的果膠酶酶活檢測方法,是十分迫切和必要的。
2果膠酶的酶促作用機理
果膠酶是一類復合酶,是指分解果膠質的多種酶的總稱。我們測定的酶活值通常是這一類復合酶協同作用的綜合結果。果膠酶可分為兩大類:解聚酶和果膠酯酶。解聚酶主要是通過水解作用和反式消去作用,切斷果膠和果膠酶分子α-1,4糖苷鍵,將果膠分子降解為小分子。果膠酯酶的作用是使果膠分子中的甲酯水解,最后形成果膠酸。
果膠質主要是由Ｄ-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物。部分Ｄ-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化、形成甲酯,或被一種或多種堿部分或全部中和。果膠質在植物的細胞組織中起著“粘合”作用,在棉纖維的初生胞壁中,果膠質含量約占9%,而麻纖維則更高。
通過果膠酶的作用,將果膠質降解為小分子物質,從纖維中游離出來,可使與其粘合在一起的其它雜質(如蠟質、蛋白質、灰份等)與纖維素徹底分開,達到棉精煉或麻脫膠的目的。
對于紡織行業,需要的是將果膠催化水解成可游離出纖維的、小分子物質的果膠酶活性(力),因此,主要測定解聚酶的活力。解聚酶對果膠分子的酶促催化作用表現為,每切斷一個果膠分子的α-1,4糖苷鍵,就會形成一個還原性醛基。通過測定這些還原性醛基生成的量,即可判定解聚酶的酶活力。
3測定酶活力(性)的基本原理
酶作為一種生物催化劑,其酶活力值是與其催化效率及有效(即有生物活性)酶的含量相關的。酶活力是酶在單位時間內將底物轉化為反應產物的
根據酶促反應動力學的米氏學說,從酶被底物飽和的現象出發,按照“穩態平衡”假說的設想,可推導出如下公式:
產物生成速率=ｋ3[總酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)
式中:[總酶]———酶的總濃度(ｍｏｌ/ｍＬ);
[底物]———底物濃度(ｍｏｌ/ｍＬ);
ｋ3———在酶促反應的第二步,形成最終產物的速率常數;
ｋｍ———米氏常數(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是當酶反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度。
要估計[總酶],首先要固定所有可控制的獨立變量,如ｐＨ值、溫度等。
當[底物]>>Ｋｍ時,底物對反應速率的影響可忽略(酶飽和),酶促反應達到最大反應速率Ｖｍａｘ,其結果是:
產物生成速率=ｋ3[總酶]=Ｖｍａｘ=Ｕ
Ｕ就成為總酶量的一種測量。因此,可以通過測定Ｕ來反映酶制劑中有效酶蛋白的含量。
4果膠酶酶活的測定方法概述和比較
測定果膠酶酶活的方法有很多,但基本上都是利用酶促分解果膠產生的粘度下降或生成的還原性醛基來測定果膠酶酶活。這些方法概括起來主要有粘度降低法、滴定法和分光光度法3種。本文分別選取一種較典型的測定方法加以介紹。
4.1粘度降低法
4.1.1原理
果膠溶于水后形成粘稠狀溶液,其粘度和溶解度與其聚合和酯化程度有關。可以利用果膠的這種性質,測其酶活力。即在一定溫度、酶濃度下和一定反應時間內,測定標準果膠溶液粘度的降低率。
4.1.2操作方法
浴中保溫10ｍｉｎ后,加入1ｍＬ酶液,繼續保溫,在不同時間分別測定反應混合液流出粘度計小球的時間。對照實驗采用經熱處理已失活的酶液。
4.1.3計算
粘度下降百分數可用下式表示:
粘度
式中:Ｔ、Ｔｏ和Ｔα分別為反應混合液、對照混合液和緩沖液的流出時間(ｓ)。
酶溶液要預先稀釋,使粘度降低范圍在20%～80%。在此范圍內,酶濃度對數與粘度降低率成正比。以酶作用時間為橫坐標、粘度下降百分數為縱坐標做標準曲線,在圖中查出粘度下降50%時對應酶的作用時間(Ｔ1/2)。在上述條件下,引起粘度下降50%的酶量為10個果膠酶活力單位,即酶活單位=10/(Ｔ1/2/3600)。
4.2滴定法
4.2.1原理
果膠酶徹底水解果膠,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可與碘(過量)反應。反應后剩余的碘可用硫代硫酸鈉溶液滴定,據此可得出酶解反應產生的半乳糖醛酸的量。以生成半乳糖醛酸的量衡量果膠酶的活力。
4.2.2測定方法
取1%果膠溶液10ｍＬ,加入到5ｍＬ酶液和5ｍＬ水,調ｐＨ至3.5,在50℃水浴中保持2ｈ,取出加熱煮沸。冷卻后,取5ｍＬ反應液移入碘量瓶中,加1Ｍ碳酸鈉溶液1ｍＬ,0.1Ｎ碘液5ｍＬ,搖勻,加塞,于室溫下放置20ｍｉｎ,加2Ｎ硫酸2ｍＬ,用0.05Ｎ硫代硫酸鈉滴定至淡黃色,加0.5%淀粉指示劑1ｍＬ,繼續滴定至藍色消失為止。記錄所消耗的硫代硫酸鈉毫升數Ａ。空白試驗用10ｍＬ果膠溶液、10ｍＬ水,不加酶液,不經保溫,直接取此混合物5ｍＬ于100ｍＬ三角瓶中用于滴定,記錄消耗的硫代硫酸鈉毫升數Ｂ。
4.2.3計算
在上述條件下,1ｈ酶促轉化果膠、生成1ｍｇ當量游離半乳糖醛酸所需的酶量定為一個酶活單位。
每毫升酶液的活力單位=(Ｂ-Ａ)Ｎ×0.51×20.(5×2×5)(3)
式中:Ｎ———硫代硫酸鈉的當量濃度;
0.51———1ｍｇ當量硫代硫酸鈉相當于0.51ｍｇ當量的半乳糖醛酸;
20———分解果膠反應液的總體積數;
5、2、5———分別表示反應中加入酶液的毫升數、反應時間、滴定時所取反應液的毫升數。
4.3分光光度法
4.3.1原理
果膠酶分解
4.3.2操作方法
取0.5%果膠溶液0.5ｍＬ加入到0.5ｍＬ酶液中,搖勻。在50℃水浴中準確反應0.5ｈ,取出后,迅速在沸水浴中加熱5ｍｉｎ,冷卻。取0.5ｍＬ反應液移入加有0.5ｍＬＤＮＳ試劑的試管,加4ｍＬ蒸餾水,搖勻,在沸水浴中加熱5ｍｉｎ,迅速冷卻。用分光光度計在540ｎｍ處測其吸光度值。參比液配制:加熱滅活5ｍｉｎ的0.5ｍＬ的稀釋酶液與0.5ｍＬ0.5%果膠溶液充分混合。
4.3.3計算
采用標準曲線法,配制一系列已知濃度的標準葡萄糖溶液,在540ｎｍ處測定吸光度(Ａ),以葡萄糖濃度(Ｃ)為橫坐標、吸光度(Ａ)為縱光標作Ａ.Ｃ標準曲線(參見5.2節圖2)。由標準曲線可得公式:
Ａ=斜率×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)(4)
未知試液測定吸光度值Ａ后,可通過上式求得Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)。
在上述條件下,每小時內每毫升果膠酶酶促轉化果膠生成1ｍｇ當量還原糖(以半乳糖醛酸計)所需的酶量定義為一個酶活單位。即:
果膠酶活(ｍｇ半乳糖醛酸/ｍＬ·ｈ)=酶液稀釋倍數×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)×2×194/180(5)
式中:194/180———葡萄糖換算成半乳糖醛酸的量;
2———測定中稀酶液被0.5%果膠溶液稀釋的倍數。
4.43種方法的比較
將粘度降低法用來測定果膠酶的復合酶活力比較準確,但操作過程也相對復雜,且測定靈敏度不高。滴定法設備使用簡單,測試重現行好,準確度高,但測定時間長,過程較繁瑣,試劑用量較大。而分光光度法測定的靈敏度、準確度均高,重現性好,試劑用量少,尤其是操作省時、簡便。對于上述3種測定方法,根據紡織行業的特點,筆者認為分光光度法更適于紡織工作者應用。下面重點探
5應用ＤＮＳ比色法測定果膠酶酶活
5.1果膠溶液的配制以及酶液的稀釋
果膠溶液的配制濃度以及酶液的稀釋倍數是相互聯系的兩個數據,它們的確定對酶活測定結果的正確性起著關鍵作用。通過完成以下試驗,可以確定有關參數條件。
5.1.1材料與方法
5.1.1.1儀器與試劑
ＵＶ—9200分光光度計;果膠(Ｓｉｇｍａ)、果膠酶制劑(ＮＯＶＯ)、3,5-二硝基水楊酸、巴比妥酸、巴比妥鈉。
5.1.1.2溶液配制
ＤＮＳ試劑:將6.3ｇ3,5-二硝基水楊酸、262ｍＬ2ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ加到500ｍＬ含182ｇ酒石酸鈉的熱水溶液中,再加5ｇ苯酚及5ｇ亞硫酸鈉,待溶解、冷卻后,加蒸餾水定容至1000ｍＬ,貯于棕色瓶中,一周后即可使用。
5.1.1.3配制巴比妥緩沖液(ｐＨ=8.6)
稱取1.84ｇ巴比妥酸,置于56～60℃水中溶化,然后加入10.3ｇ巴比妥鈉,加蒸餾水定容至1000ｍＬ。
5.1.1.4配制0.5%果膠溶液
準確稱取0.5ｇ果膠于燒杯中,用巴比妥緩沖液(ｐＨ=8.6)溶解、稀釋定容至100ｍＬ。
5.1.2制作果膠酶稀釋倍數與吸光度關系曲線
分別按表1的稀釋倍數用蒸餾水稀釋果膠酶,將稀釋酶液按4.3.2測定吸光度值,以果膠酶稀釋倍數的倒數為橫坐標,吸光度(Ａ)為縱坐標作關系曲線(見圖1)。
